不同荧光素之间会存在波长重叠（如下图），调整补偿是流式细胞术中通过数学建模校正荧光信号光谱重叠（Spectral Overlap）的过程。由于荧光染料的发射光谱存在交叉（例如PE-Cy7的发射光会部分进入APC检测通道），仪器采集的“原始信号”实则是多染料信号的混合体。补偿通过计算各通道间的信号渗漏比例，逆向还原每个荧光通道的“纯净值”，如同为重叠的色谱赋予精准的“分离滤镜”。

1、数据保真基石：消除假阳性/假阴性干扰，确保弱表达信号（如低丰度表面标志物）不被邻近强信号掩盖，使荧光强度真实反映生物标记物的表达水平。

2、多色实验赋能者：突破荧光染料数量的物理限制，允许研究者灵活组合PE、FITC、APC等染料，实现单个样本中数十种细胞参数的同步解析。

3、跨平台一致性保障：通过标准化补偿矩阵，消除仪器硬件差异（如激光器功率、滤光片批次）对数据的影响，使不同实验室、不同机型的结果可比可重复。

1、打开FlowJo软件，点击打开FCS，选择需要进行分析的FCS文件。

2、双击样本blank，弹出圈门框,选择通道（红色箭头），进行圈门（蓝色箭头）。

3、圈出目的细胞后，双击所圈细胞，进行下一个圈门（排除粘连体）；之后进行十字门（红色箭头）画门。荧光通道画门时，因为用blank进行画门，所以细胞都为阴性，所圈细胞数基本小于1，在十字画门中在左下象限。

4、画门后若进行名称修改，则右键单击所要修改的名称，点击“Rename”，弹出编辑框，进行名称修改。

5、一个样本的所有圈门完成后，将门选住，拉入“All Samples”中，应用于所有样本中。

6、进行圈门检查。从一开始的圈门开始，检查所有样本的圈门。进行荧光通道圈门检查时，当细胞有明显分群现象，且多数都为这样时，我们应根据分群进行画门。

7、调整后该样本所在门为浅色，因此要进行应用于所有样本。鼠标右键点击门，选择“Copy analysis to group”。

8、单阳时，是只有一种染色，因此在其他单阳管中基本无阳性。当一个单阳画好门后，另一个单阳（样本管）门不对时，且两个荧光通道相邻或者波长接近，我们要考虑是否要调补偿。

9、当样本前面的格子为空白格时（红色），FCS文件没有补偿；当样本前面的格子为空白九宫格时（绿色），FCS文件自带补偿。双击格子矩阵，进入手动补偿界面（红色框为无补偿的手动调节界面，绿色框为自带补偿的手动调节界面）。

10、当FCS文件自带补偿时，点击Edit对已建立的补偿进行编辑。

11、去掉不用调补偿的通道，对要进行补偿的通道更改补偿值（选择对应的荧光通道），可以预览调节和未调节补偿（蓝色散点图为调补偿前，黑色散点图为调补偿后）。

12、补偿调节后九宫格矩形框变成对应的颜色。

13、之后就可以进行正常分析了。左边为未调补偿；右边为调了补偿。

14、当细胞有明显分群现象，且多数都为这样时，我们应根据分群进行画门。

15、当FCS文件没有补偿时，矩阵页面弹出，选中最左下角的“+”，选择“New ldentity Matrix”。在弹出的界面中选择需要调补偿的通道，按住Ctr可以多选。

16、在界面中输入想要调整的数字。可以预览调节和未调节补偿（蓝色散点图为调补偿前，黑色散点图为调补偿后）。

17、这时补偿还没有应用到样本上，将补偿界面最上方的“”拖入主界面的“All Samples”样本中，样品的补偿通道就会打开。

18、这可以看到此时调过补偿，而圈门图中没有变化，重新选择横纵坐标（黄框），选择调过补偿的荧光通道。根据细胞分群重新画门。

19、删除调补偿前的画门（黄框），更改补偿后画门的门名称（红框），应用到所有样本。

20、自动补偿，将单阳管拉入“Compensation”，现在显示为“2”。

21、单击“Compensation”，进入补偿组中，点击“”，选择荧光通道，进入自动补偿界面。

22、检测单染管圈门情况（红色框），检查单阳管是否分阴性和阳性（黄色框），重新调整分区。双击直方图，弹出画门框，进行分区画门。紫色区域为阴性，绿色区域为阳性。

23、单击“”，弹出补偿调节界面，可以选择不同样本是否调整（蓝色散点图为调补偿前，黑色散点图为调补偿后）。

24、此时补偿还未应用到样本中，单击“”选择“AllSamples”，或者将“”拖入主界面的“All Samples”样本中，补偿应用到样本中。

25、这可以看到此时调过补偿，而圈门图中没有变化，重新选择横纵坐标（绿框），选择调过补偿的荧光通道。根据细胞分群重新画门。

26、删除调补偿前的画门（红框），更改补偿后画门的门名称且应用到所有样本（绿框）。

27、之后的分析按照“图片导出”中“3”开始往后操作，就能导出想要的流式图片。