1. 基质胶准备
材料：Matrigel（浓度≥10 mg/mL，如 BD Biosciences 或CORNING 产品）、预冷枪头、冰盒。
操作：
i.解冻：提前 1 天将 Matrigel 置于 4℃冰箱缓慢解冻，解冻时可将基质胶放入冰块中，以确保基质胶能够完全溶解。
ii.铺胶：孔板放置在冰上或低温金属盒上，用预冷枪头将 Matrigel加入至 96 孔板，每孔50-80 μL（24孔板需150-300 μL），吸取基质胶时，为了避免气泡生成，吸胶可至移液枪第二停点，打胶打至第一停点即可。
iii.凝胶化：将板置于37℃培养箱30-60分钟，直至 Matrigel 完全凝固（表面平整无气泡）。
2. 细胞准备
细胞类型：常用细胞包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠3B-11细胞系、小鼠SVEC4-10细胞系等。
操作：
i.饥饿处理：实验前将细胞培养基更换为含0.2% FBS的培养基，过夜培养即可，以此增强细胞对生长因子的敏感性。
ii.消化与计数：ii.胰酶消化3-6代细胞，用台盼蓝染色检测活率（>95%），调整密度至 3-5×104 cells/mL。
3. 细胞接种与培养
操作：
i.接种：将细胞悬液加入已凝固的 Matrigel 表面，每孔100-200 μL（HUVEC 推荐密度3-5×104 cells /孔，肿瘤细胞需预实验优化）。
ii.培养：将板置于37℃、5% CO2 培养箱，培养3-12小时（HUVEC 通常6-8小时成管，肿瘤细胞可能需12-24小时）。
4. 观察与染色
方法：
直接观察：相差显微镜下观察管状结构（典型形态为多边形网格，管腔直径约 50-100 μm）。
荧光染色（可选做）：
a.移除培养基，无需使用PBS洗涤，反复加入液体洗涤可能会导致管腔结构破坏。
b.加入 Calcein AM（1:1000 稀释），37℃避光孵育 30 分钟。
c.荧光显微镜下拍照（激发波长 494 nm，发射波长 517 nm）。
5. 定量分析
工具：Image J 插件 Angiogenesis Analyzer 或 AngioTool 软件。
指标：
Tot. lenght（管腔长度）：反映血管网络复杂度。
Nb branches（支点数）：评估血管生成活性。
1. 基质胶处理
温度控制：Matrigel 在 4℃以上易凝固，操作全程需在冰上进行，枪头和 EP 管需预冷。
气泡避免：垂直滴加 Matrigel，避免枪头接触孔壁；若有气泡，4℃、300g 离心 10 分钟。
批次验证：不同批次 Matrigel 成分差异可能影响实验结果，需预实验验证。
样品分装：首次溶解后的Matrigel需直接分装保存于-20℃
2. 细胞状态优化
代数限制：常用细胞包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠3B-11细胞系、小鼠SVEC4-10细胞系等。HUVEC建议使用2-6代，原代细胞不超过12代；
密度优化：细胞密度过高易导致管腔重叠，过低则无法形成连续网络，需通过预实验确定最佳密度（96孔板中HUVEC通常3×104 cells /孔）。
饥饿处理：血清饥饿可增强细胞对生长因子的响应，但过度饥饿会导致细胞凋亡，建议饥饿时间不超过 24 小时。
3. 培养条件
时间窗口：HUVEC 成管高峰在 6-8 小时，肿瘤细胞可能延迟至 12-24 小时，需定期观察避免错过最佳拍照时间。
避免扰动：培养过程中避免移动或摇晃培养板，防止破坏脆弱的管状结构。
4. 染色与成像
染色剂选择：Calcein AM适用于活细胞染色，若需要对管腔进行血管相关免疫荧光指标染色。
成像参数：选择低倍镜（如10×）拍摄整体网络，高倍镜（如20×）观察局部细节，确保曝光时间一致以利定量分析。
5. 常见问题与解决方法
四、进阶技巧与优化策略
1. 肿瘤细胞成管实验
基质胶选择：使用低生长因子 Matrigel（如 BD Matrigel Growth Factor Reduced），排除外源性生长因子干扰。
条件培养基：添加肿瘤细胞条件培养基（含 VEGF、bFGF）可增强成管效果。
2. 药物处理
抗血管生成药物：如贝伐珠单抗（Bevacizumab），可在细胞接种时加入，终浓度 1-10 μg/mL。
促血管生成药物：如VEGF重组蛋白，推荐浓度50-100 ng/mL。
3. 3D 培养优化
共培养模型：将内皮细胞与肿瘤细胞或成纤维细胞共培养，模拟肿瘤微环境。
动态培养：使用微流控芯片或旋转培养瓶，引入流体剪切力，促进管腔成熟。
五、结果示例与分析
典型结果：
阳性对照：HUVEC 在 Matrigel 上形成密集的多边形网络，管腔清晰可见。
药物处理组：抗 VEGF 药物显著抑制管腔形成，表现为管状结构减少、分支点稀疏。
定量分析：
统计方法：每组设置 3-6 个复孔，采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异。
数据呈现：以管状结构总长度、分支点数等指标进行柱状图或折线图展示。
成管实验是研究血管生成的重要工具，其核心在于严格控制实验条件（如基质胶质量、细胞状态）和优化操作细节（如避免气泡、染色技巧）。通过结合荧光染色、定量分析及 3D 培养技术，可深入解析血管生成的分子机制或评估药物疗效。实验中需注意批次差异和预实验优化，以确保结果的可靠性和重复性。
