实验动物：选用SPF级SD新生大鼠，出生48h内纳入实验，体重控制在8-10g，雌雄各半，避免因体重、性别差异影响造模结果。
实验试剂与器材：人工代乳品（模拟早产儿配方奶，精准配比蛋白质、脂肪、乳糖）、无菌生理盐水、缺氧舱、低温培养箱、电子天平、灌胃针、病理切片制作全套器材等，所有器材提前灭菌，确保实验环境无菌无干扰。
实验分组：将仔鼠随机分为正常对照组与NEC模型组，正常组仔鼠跟随母鼠自然哺乳，常规环境饲养；模型组采用多因素联合干预造模。
采用国际公认的人工喂养+缺氧+冷刺激三因素联合造模法，最大程度模拟早产儿NEC发病诱因，操作步骤如下：
1、人工灌胃喂养
模型组仔鼠脱离母鼠，采用无菌灌胃针经口灌胃人工代乳品，每3h灌胃一次，每日8次，每次灌胃量根据仔鼠体重确定（约10-20uL/g），模拟早产儿非母乳喂养模式，破坏肠道正常菌群定植与屏障功能。
2、缺氧干预
每次灌胃结束后，将仔鼠放入密闭缺氧舱内，保持5%氧气+95%氮气10min，模拟新生儿缺氧缺血状态，诱发肠道黏膜缺血损伤，这是NEC发病的核心诱因之一。
3、冷刺激干预
缺氧干预完成后，立即将仔鼠放入4℃低温培养箱，持续10min，通过冷刺激加重肠道血液循环障碍，诱发肠道炎症反应，进一步强化NEC病理特征。
4、造模周期
连续干预72h（3天），期间密切观察仔鼠精神状态、进食情况、腹部体征，记录体重变化、排便状态，正常组全程不做任何干预，同步饲养观察。
造模结束后，通过大体观察、组织病理检测、分子检测三维度评估模型是否构建成功，核心检测指标如下：
1、大体形态观察
处死仔鼠后，迅速取出完整回肠、结肠组织：
正常对照组：肠道色泽红润、管壁柔软、无胀气、无渗出，内容物正常；
NEC模型组：典型腹胀、肠管扩张充气，肠壁充血水肿，严重者可见肠壁坏死、发黑、穿孔，腹腔出现血性渗出液，与临床NEC患儿大体表现高度一致。
2、组织病理检测（HE染色）
将肠道组织固定于4%多聚甲醛溶液，常规脱水、石蜡包埋、连续切片，行HE染色，光学显微镜下观察病理改变：
对照组--HE.svs_100x（左）；HE.svs_200x（右）未见明显病变
模型组--HE.svs_100x（左）；HE.svs_200x（右）绒毛坏死/萎缩（黑色箭头）、充血/出血（红色箭头）
模型组--HE.svs_100x（左）；HE.svs_200x（右）绒毛坏死/萎缩（黑色箭头）、炎细胞浸润（蓝色箭头）、黏膜下层水肿（绿色箭头）
3、辅助分子生物学检测
通过免疫荧光检测肠道炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-10）表达水平，模型组炎症因子表达显著高于对照组，验证肠道炎症反应激活，从分子层面佐证NEC模型构建成功。
对照组（左），模型组（右）--TNF-α 400x
对照组（左），模型组（右）--IL-6 400x
对照组（左），模型组（右）--IL-10 400x
